PCR – Cobas


– Princípio do método
O método consiste em multiplicar um trecho específico do DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis, Junk DNA, etc.) utilizando desoxinucleotídeos como monômeros até um ponto em que sua concentração em dada solução seja tão alta que possa ser facilmente detectável por métodos simples e clássicos de separação e identificação de substâncias.
A multiplicação destes trechos específicos se dá alternando-se a temperatura de ensaio entre: a) Desnaturação das cadeias do DNA genômico; b) anelamento (?annealinng?) dos ?primers?, usados para delimitar a seqüência a ser amplificada; c) temperatura ótima específica da enzima: 72ºC; d) reinício do ciclo.
O sistema Cobas® 4800 é um teste automatizado que tem como objetivos eliminar a dificuldade o fluxo manual, reduzir o TAT e aumentar a escala, oferecer uma plataforma para testes de ?screening? (ex.: CT/NG and HPV), performance tanto do ponto de vista analítico quanto clínico, ajustado aos algoritmos e ?guidelines? dos testes atuais.
É um teste qualitativo multiplex em um único tubo, com detecção simultânea de 12 genótipos de alto risco (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68), identifica separadamente HPV tipos 16 e 18 e tem ß-globin como controle interno, que reduz a possibilidade de resultado falso-negativo, alertando quando a amostra não possuir células coletadas. E apresenta 4 canais de detecção para medir os diferentes alvos:
– Equipamentos
cobas x 480 Instrument
– Purificação de ácido nucléico totalmente automatizada
– Tubos primários de múltiplos formatos
– Leitura automática do código de barras de amostras
– ?Batches? de 24 ou 96
– Montagem de PCR automática
cobas z 480 Analyzer
– Baseado na tecnologia do LightCycler® 480
– Microplacas de 96
– Detecção em 4 canais
– Coleta
A coleta do material é realizada através da descamação com escova específica, a mesma utilizada na metodologia da citologia em meio líquido Sure Path®, disponibilizada pelo Laboratório Prof. Eleutério da Costa, onde o médico fará a coleta normalmente, e destacará a ponta da escova em recipiente específico contendo o meio líquido para conservar as células. Este frasco será fechado, identificado e enviado ao Laboratório. A amostra coletada pode permanecer 1 mês em temperatura ambiente e 6 meses refrigerado (2-8ºC).

Captura Híbrida


Pesquisa de DNA-HPV
Pesquisa de Chlamydia trachomatis
Pesquisa de Gonococo
O Laboratório Professor Eleutério da Costa é um dos pioneiros na realização do exame de biologia molecular Captura Híbrida segunda geração, da Qiagen®. Trata-se de um teste de alta sensibilidade e especificidade, em que há uma detecção qualitativa e quantitativa de DNA do HPV, Chlamydia e/ou Gonococo. É um exame que auxilia na conduta clínica, sendo amplamente utilizado para detecção do HPV (baixo ou alto risco oncogênico), direcionando o tratamento. Também é detectada a carga viral, calculada a partir da quantidade de DNA presente na amostra.
CAPTURA HÍBRIDA
Princípio do método
A Captura Híbrida é uma solução hibridizadora que utiliza anticorpos na captura dos híbridos que são detectados por quimioluminescência através da amplificação de sinal. Os espécimes contendo DNA hibridizam-se com o coquetel de sonda específico de RNA-HPV. Os híbridos RNA/DNA são capturados sobre a superfície da microplaca sensibilizada com anticorpos específicos para os híbridos RNA/DNA. Híbridos imobilizados reagem com a fosfatase alcalina conjugada com anticorpos específicos para híbridos RNA/DNA e são detectados por substrato quimioluminescente.
Várias moléculas de fosfatase alcalina são conjugadas para cada anticorpo. Múltiplos anticorpos conjugados se ligam a cada híbrido capturado resultando na amplificação de sinal. A luz é emitida e medida em Unidade de Luz Relativa (RLU) no quimioluminômetro.
A intensidade da luz emitida denota a presença ou ausência do DNA nos espécimes. A medida RLU igual ou acima do Valor do cutoff indica a presença da seqüência específica de DNA-HPV no espécime. RLU menor que o valor do cutoff indica a ausência da seqüência de DNA-HPV específico ou que os níveis de DNA-HPV estão abaixo do limite de detecção do ensaio.
O ensaio conta com controles negativos e positivos, que são testados em triplicata. As leituras dos controles são utilizadas para a validação e o cálculo do cutoff. Para validação, sempre se deve observar os critérios abaixo:
– O coeficiente de variação das leituras entre os micro poços dos controles negativos e positivos não deve ultrapassar 25%.
– A divisão da média das leituras de RLU dos controles positivos pelos negativos deve ser superior a 2,0
– Os controles negativos devem respeitar o limite máximo de background de 250 RLU.
Há ainda dois outros controles intra-teste. O primeiro é quando se faz a adição do reagente de desnaturação. Todas as amostras devem tornar-se de cor roxa, isso dá a certeza de que todo material será desnaturado. O segundo, quando da adição das sondas, a coloração deve mudar de roxo para amarelo, assegurando que todas as amostras receberam a quantidade ideal de sonda.
Coleta para HPV, CT e GC
Esfoliado Celular na Mulher:
1. Recomendável abstinência sexual de três dias, a paciente não deve estar menstruada e a coleta deve preceder exames do trato genital inferior.
2. A presença de sangue (não menstrual) ou de conteúdo vaginal anômalo não altera o resultado para os testes de Captura Híbrida.
3. É importante retirar com bola de algodão ou gaze o conteúdo vaginal ao redor do colo.
4. Introduzir toda a escova no canal cervical, entre 1 a 1.5 cm, até que as cerdas maiores toquem a região ectocervical. Rodá-la cinco (5) vezes no sentido horário. A seguir, escovar a ectocérvice.
5. Imediatamente após a coleta inserir a escova no tubete, dentro da solução de STM®.
6. Quebrar a haste da escova. Existe uma pré-marcação para este fim.
7. Fechar o tubete e agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra.
8. Enviar o tubete com o STM® à Unidade mais próxima.

Esfoliado Celular no Homem
1. É recomendável abstinência sexual de três dias e a coleta deve preceder exames do trato genital inferior.
2. Recomenda-se a utilização prévia por 5 minutos, de solução líquida de lidocaína a 2% sem vaso-constritor na uretra.
3. Introduzir as cerdas da escova na uretra distal, entre 1 a 1,5 cm, rodando-a cinco (5) vezes no sentido horário. A seguir, escovar a glande, sulco bálano-prepucial e o prepúcio.
4. Imediatamente após a coleta inserir a escova no tubete, dentro da solução de STM®.
5. Quebrar a haste da escova. Existe uma pré-marcação para este fim.
6. Fechar o tubete e agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra.
7. Enviar o tubete com o STM® à Unidade mais próxima.
Fragmento de Biópsia
1. O fragmento deve ter de dois a cindo milímetros de diâmetro.
2. Imediatamente após a biópsia, com o auxílio da escova, inserir no tubete o(s) fragmento(s) dentro da solução de STM®.
3. Fechar o tubete e agitar o coletor durante aproximadamente 30 segundos para homogeneizar a amostra.
4. Enviar o tubete com o STM® ao seu laboratório de preferência.

Citologia Oncótica cérvico-vaginal (Papanicolaou)

Citologia Oncótica cérvico-vaginal (Papanicolaou)
O Papanicolaou é um exame que deve ser feito periodicamente por todas as mulheres sexualmente ativas.
Este teste tem como objetivo analisar ao microscópio células provenientes da coleta realizada pelo médico ginecologista no consultório, e o material é encaminhado ao Laboratório para processamento e análise da microscopia.
A coleta começa com a introdução do espéculo na vagina para inspeção da vagina e colo uterino. Em seguida realiza-se a coleta do material através da espátula e/ou escova apropriados, com transferência das células para a lâmina, devidamente identificada, que será enviada ao laboratório em recipiente com álcool para a preservação.
Ao chegar ao Laboratório haverá a identificação das amostras, e estas serão encaminhadas ao setor do Processamento, onde será feita a coloração, que em nossa Empresa, é realizada pelo Corador Automático, de maneira padronizada com a mais alta qualidade. Após coradas, as lâminas são montadas em capela, utilizando lamínulas e encaminhadas para a Microscopia, onde as serão lidas e terão laudos descritivos, que serão digitados e liberados no Software, e posteriormente impressos e enviados aos respectivos Consultórios ou também podem ser visualizados na internet, em nosso site.
Oncótica em meio líquido ? SurePath ®
Em um teste de Papanicolaou convencional, as células do colo uterino coletadas são dispostas sobre a lâmina de vidro, e as espátulas e escovas utilizadas, que ainda contêm grande número de células, são descartadas, fazendo com que parte das células que poderiam estar alteradas não sejam analisadas, o que poderia levar a resultados insatisfatórios ou falso-negativos.
A tecnologia SurePath® foi desenvolvida pela BD, e traz como diferencial a retirada da ponta da escova utilizada na coleta das células do colo uterino, que é destacada em um frasco contendo solução conservante (meio líquido).
Adotado nos grandes centros de pesquisa em todos mundo, 90% dos Estados Unidos e na maior parte da Europa, onde as taxas de incidência de câncer de colo uterino caíram consideravelmente, o Papanicolaou em meio líquido traz algumas vantagens tanto para pacientes, médicos e laboratórios:
Garantia de envio para análise do Laboratório de 100% do material coletado, proporcionado melhores resultados.
– Aumento de 64,4% na detecção de lesão de alto grau (HSIL).
– Redução significativa de exames insatisfatórios, diminuindo a necessidade de repetição da coleta e do exame.
– Eliminação de materiais interferentes (sangue, muco) possibilitando um diagnóstico mais preciso.
– Possibilidade de realização, pelo Laboratório, de testes complementares a partir da mesma amostra, como testes de biologia molecular, sem a necessidade de uma recoleta.

A coleta inicia, como no Papanicolaou convencional, com a introdução do espéculo na vagina para inspeção da vagina e colo uterino. Em seguida realiza-se a coleta do material através da escova específica, disponibilizada pelo Laboratório Prof. Eleutério da Costa, onde o médico fará a coleta normalmente, e destacará a ponta da escova em recipiente específico contendo o meio líquido para conservar as células. Este frasco será fechado, identificado e enviado ao Laboratório. A amostra coletada pode permanecer 1 mês em temperatura ambiente e 6 meses refrigerado (2-8ºC).
Ao chegar ao Laboratório haverá a identificação das amostras, e estas serão encaminhadas ao setor do Processamento, onde será realizada a montagem das lâminas a partir do meio líquido contendo as células. Em nenhum momento o frasco é aberto. O equipamento BDPrepMate® utiliza seringas para transferir o líquido para tubos de centrifugação com líquido de densidade, a fim de separar as células de hemácias, muco e leucócitos e facilita a visualização das células. Após a centrifugação retira-se o sobrenadante com a bomba de vácuo e utiliza-se solução tampão. Agita-se no vortex e pipeta dentro de um delimitador na lâmina, onde ficará por alguns minutos, e posteriormente será lavado com álcool para fixar as células por diversas vezes.
O próximo passo é a coloração, que é realizada pelo Corador Automático, de maneira que padronize os corantes nas lâminas, e tenhamos a mais alta qualidade. Após coradas, as lâminas são montadas em capela, utilizando lamínulas específicas fornecidas pela BD e encaminhadas para a Microscopia, onde as lâminas serão lidas e terão laudos descritivos, que serão digitados e liberados no Sotware, e posteriormente impressos e enviados aos respectivos Consultórios ou também podem ser visualizados na internet, em nosso site
Trazendo mais esta tecnologia em seu serviço, o Laboratório acredita trazer maior praticidade para médico e paciente, além da qualidade em todas as etapas deste processo semi-automatizado.